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武汉合研生物医药科技有限公司
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激酶活性筛选/测试
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实验技术服务之定制开发服务
649 人阅读发布时间：2020-11-23 17:23
在药物研发早期，建立离体的筛选模型无疑是一种经济而高效的策略，也是我们的优势服务。合研生物在药物筛选模型建立方面有着丰富的经验，平台主要成员均拥有多年为国外知名药企建立模型的经验，我们熟练掌握HTRF、报告基因方法、荧光偏振（FP）、ELISA、Alpha sreen检测方法、ADP-Glo、LANCE等各项技术方法，精通G蛋白偶联受体，离子通道和报告基因等细胞水平和非细胞水平的各种模型构建，为药物早期研发的高通量筛选和结构及效果研究（SAR）提供了模型基础，合研生物药物筛选平台自主开发新的药物筛选靶点细胞株、各种诱导药物筛选模型以及药物通透性与转运体研究模型等，正在逐渐丰富细胞水平的药物靶标或非靶标筛选模型，也可根据客户要求进行定制模型的开发与验证。
1、稳转细胞系构建
稳转细胞系构建，顾名思义就是通过稳定转导获得的持续稳定表达特定基因的细胞系，或者干扰特定基因表达的细胞系。用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。
具体来说，细胞转导是将外源分子编码基因导入真核细胞使其表达的一种技术。按照外源分子编码基因转入宿主细胞后是否整合到宿主的染色体中进行表达，可分为瞬时基因表达（transient gene expression,TGE）和稳定基因表达(Stable gene expression,SGE)两种。瞬时转导是指外源DNA或RNA 转入宿主细胞后不整合到宿主染色体中进行外源目的基因表达。
针对瞬时转染，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量很少，能够满足小量蛋白的制备，大量生产成本很高。
稳定转导是指外源DNA转入宿主细胞后整合到宿主染色体中进行外源目的基因表达。慢病毒感染-药物筛选法是目前广泛运用的稳转株构建方法，具有高效整合，目标细胞广泛等特点。最常用的真核表达载体抗性筛选标志物有新霉素（neomycin），潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素（puromycin）。常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
稳转细胞系在医药研发的各个阶段都具有重要的作用。具体到抗体研发领域，稳转细胞系可以作为免疫原，激发动物针对该免疫原的特异免疫反应，尤其对于多次跨膜蛋白类型的靶点具有其特殊优势。另外稳转细胞系广泛应用到抗体结合和功能筛选实验中。
重组细胞株是新药研发过程中常用的研发工具，相对于原代细胞模型，重组细胞模型易大量获得，信号稳定，更适用于新药研发的早期筛选。合研生物提供稳定细胞系构建的服务，包括各个类型的GPCR和报告基因等功能检测细胞系以及特定蛋白高表达的细胞株，如BaF3细胞株上表达突变的激酶靶点等。我们的细胞系都通过功能学的验证和稳定性的测试，能够为客户的药物研发提供很好的支持。
2、 蛋白互作体系开发
蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体（protein complex）的过程。揭示蛋白互作对于理解细胞信号转导的分子机制至关重要。
研究蛋白作用的方法有很多，比较经典的方法有：酵母双杂交，CoIP和GST-pulldown。
酵母双杂交技术是验证蛋白间相互作用的经典方法之一。原理是在真核细胞调控转录过程中的转录激活因子GAL4的两个结构域：DNA结合域BD与转录激活域AD在分离的时候不具有转录激活功能，而当两者结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。因此，我们将所要研究的目的基因（蛋白A和蛋白B）分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因的表达。
免疫共沉淀是另一种研究蛋白相互作用的经典方法。原理是如果蛋白A与蛋白B（直接或间接）结合，那么当我们用抗体去结合蛋白A的时候，蛋白B也能被拉下来；当然，反之亦然。因此，首先提取蛋白，然后在提取的蛋白中加入蛋白X的抗体，孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)，然后变性、PAM凝胶电泳，经过Western Blot检测蛋白B，当然，也可以直接将沉淀下来的蛋白通过质谱分析其它蛋白。
GST pull down 是另一项验证蛋白相互作用的经典实验，其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过WB或者质谱进行检测和鉴定。
以上三种方法是研究蛋白互做最常用的三种方法，一般Y2H常用来筛选，Co-IP和GST pull down用来验证。研究不仅在整体蛋白层面，还包括蛋白的结构域层面，GST pulldown是用来验证蛋白A与B的直接结合的，而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。
在药物研发的众多靶点中，有一些相互作用的蛋白可以利用蛋白之间的结合特性从而开发相互结合的检测体系，武汉合研利用HTRF，AlphaLISA，报告基因及FP方法开发了多种研究蛋白互作的检测体系，用于新药药效学评价。
3、总蛋白及磷酸化蛋白检测
磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质上的过程。蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素介导的蛋白降解等过程。细胞信号转导活动都是由一系列蛋白传递链构成的，信号传导的过程中涉及到多种蛋白质的可逆磷酸化过程。蛋白质通过可逆磷酸化，以及不同的级联反应，可以将信号放大传递等。由此可见蛋白质磷酸化在细胞信号传导过程中担负着重要的作用。在新药研发涉及到的生物学实验里面，蛋白水平磷酸化和总蛋白降解对于某些靶点来说是重要的药效学评价指标。
检测磷酸化蛋白的抗体是针对该蛋白的特异性磷酸化位点的，而检测总蛋白的抗体一般针对的是该蛋白别的位点，故而磷酸化抗体检测不到总蛋白，而总蛋白抗体能检测包括磷酸化和未磷酸化蛋白在内的目的蛋白。磷酸化蛋白的Western Blotting检测是信号通路研究中的经典方法。大部分实验室具备开展该实验的条件。用 SDS-PAGE 分离生物样品，随后转移到膜（PVDF 或硝酸纤维素膜），采用磷酸化抗体鉴定目的蛋白的磷酸化水平。
由于磷酸化蛋白的检测结果可能随样本处理或操作误差而变化，研究人员通常用同一种蛋白的总表达水平作为参考，通过确定磷酸化蛋白和总蛋白的相对比值来反映磷酸化情况，判断信号通路是否被激活。
常用的WB实验细胞用量大，实验通量比较低。针对研发中的困难，我们采用ELISA，HTRF，Alpha screen等多种方法建立起96孔板的检测体系，一次可以评价多个化合物IC50，大大缩短检测时间。
针对不同的研发项目我们为客户定制开发过Erα，cIAP的蛋白降解检测体系，针对上游不同靶点的pERK检测体系和pSTAT3及pCHK1检测系统。均可高效快速的进行化合物活性评价。
4、酶学靶点开发
酶是生命体内化学反应的催化剂，能够在生理温度和常压下加快化学反应的速度，几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与以提高效率。特定酶活性或者表达量的增强或者缺少都有可能导致生命活动的异常，疾病的发生。在药物研发过程中酶是十分重要的靶点，也是十分有潜力和效果的靶点。
酶学筛选方法的几个核心参数包括酶，反应环境，底物和抑制物。一般来讲反应环境需要查阅文献进行调研，确定PH值，离子强度，洗涤剂等对酶活的影响，底物可以根据酶催化原理选择天然底物，也可以选择合成底物（底物的选择和后续配套的检测方法紧密相关）。一个酶学方法的开发可能涉及到以下一些因素：
底物的选择和配套的检测方式，如下图某蛋白水解酶，其识别的位点是氨基酸线性表位，可以人工合成多肽，在其N端和C端分别加入荧光基团和淬灭基团，正常状态下或者酶活抑制状态，该多肽在酶标仪340nm激发时，其发射光会被淬灭基团吸收，在405nm无信号产生；酶催化反应会将该多肽剪切，当酶标仪340nm激发时，405nm有信号产生。
又如某病毒逆转录酶，合成RNA模板和对应引物，在其引物上进行生物素标记，其中碱基上进行Ru标记，随着酶催化的逆转录反应的进行，引物上不断有Ru标记碱基上去形成核苷酸序列，通过亲和素的板子捕捉引物，检测Ru信号值来评判酶的催化和抑制的活性。
酶学靶点测试是直接反应化合物活性的重要体外测试。在药物筛选初期根据研究的靶点进行酶学测试体系的开发显得尤为重要。通常的药物靶点分为激酶，磷酸酶，蛋白水解酶，表观遗传学酶和DNA修复酶等。根据不同酶类的反应特点不同，我们可以帮助药物筛选研究机构建立不同类型的酶学反应体系。
1、激酶类靶点
通常利用ADP-Glo，LANCE技术或HTRF技术的方法建立反应体系，检测反应中生成的ADP或底物磷酸化来反映反应进程，如本实验室建立的100多种激酶靶点方法。
2、磷酸酶
通过底物被水解后会发生荧光水平的变化来反映反应进程，不同类型的磷酸酶通常还会用到不同的反应底物。利用这种方法本实验室成功建立SHP2 full length homogeneous assay和SHP（E76K）full length homogeneous assay。
3、蛋白水解酶
通过多肽底物被水解后Quencher dye和 Report dye分开从而发出可检测的荧光信号，利用FRET方法建立多种水解酶检测体系，如当前热门的3CLPro和PLPro等。
4、表观遗传学酶
通过HTRF或Alpha的方法检测反应后底物的变化，或SAH的生成情况建立检测体系。如本实验室成功建立的PRMT1，PRMT4，PRMT6，PRMT8等。
5、DNA修复酶
损伤的DNA会激活PARPs酶通过NAD+使核蛋白进行聚腺苷二磷酸核糖基化，从而使组蛋白与DNA分离，通过对底物的生物素标记，检测PARPs的活性，来建立检测体系。如本实验室成功建立的PARP1，PARP2，PARP5a和PARP7等。
1、稳转细胞系构建
稳转细胞系构建，顾名思义就是通过稳定转导获得的持续稳定表达特定基因的细胞系，或者干扰特定基因表达的细胞系。用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。
具体来说，细胞转导是将外源分子编码基因导入真核细胞使其表达的一种技术。按照外源分子编码基因转入宿主细胞后是否整合到宿主的染色体中进行表达，可分为瞬时基因表达（transient gene expression,TGE）和稳定基因表达(Stable gene expression,SGE)两种。瞬时转导是指外源DNA或RNA 转入宿主细胞后不整合到宿主染色体中进行外源目的基因表达。
针对瞬时转染，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量很少，能够满足小量蛋白的制备，大量生产成本很高。
稳定转导是指外源DNA转入宿主细胞后整合到宿主染色体中进行外源目的基因表达。慢病毒感染-药物筛选法是目前广泛运用的稳转株构建方法，具有高效整合，目标细胞广泛等特点。最常用的真核表达载体抗性筛选标志物有新霉素（neomycin），潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素（puromycin）。常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
稳转细胞系在医药研发的各个阶段都具有重要的作用。具体到抗体研发领域，稳转细胞系可以作为免疫原，激发动物针对该免疫原的特异免疫反应，尤其对于多次跨膜蛋白类型的靶点具有其特殊优势。另外稳转细胞系广泛应用到抗体结合和功能筛选实验中。
重组细胞株是新药研发过程中常用的研发工具，相对于原代细胞模型，重组细胞模型易大量获得，信号稳定，更适用于新药研发的早期筛选。合研生物提供稳定细胞系构建的服务，包括各个类型的GPCR和报告基因等功能检测细胞系以及特定蛋白高表达的细胞株，如BaF3细胞株上表达突变的激酶靶点等。我们的细胞系都通过功能学的验证和稳定性的测试，能够为客户的药物研发提供很好的支持。
2、 蛋白互作体系开发
蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体（protein complex）的过程。揭示蛋白互作对于理解细胞信号转导的分子机制至关重要。
研究蛋白作用的方法有很多，比较经典的方法有：酵母双杂交，CoIP和GST-pulldown。
酵母双杂交技术是验证蛋白间相互作用的经典方法之一。原理是在真核细胞调控转录过程中的转录激活因子GAL4的两个结构域：DNA结合域BD与转录激活域AD在分离的时候不具有转录激活功能，而当两者结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。因此，我们将所要研究的目的基因（蛋白A和蛋白B）分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因的表达。
免疫共沉淀是另一种研究蛋白相互作用的经典方法。原理是如果蛋白A与蛋白B（直接或间接）结合，那么当我们用抗体去结合蛋白A的时候，蛋白B也能被拉下来；当然，反之亦然。因此，首先提取蛋白，然后在提取的蛋白中加入蛋白X的抗体，孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)，然后变性、PAM凝胶电泳，经过Western Blot检测蛋白B，当然，也可以直接将沉淀下来的蛋白通过质谱分析其它蛋白。
GST pull down 是另一项验证蛋白相互作用的经典实验，其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过WB或者质谱进行检测和鉴定。
以上三种方法是研究蛋白互做最常用的三种方法，一般Y2H常用来筛选，Co-IP和GST pull down用来验证。研究不仅在整体蛋白层面，还包括蛋白的结构域层面，GST pulldown是用来验证蛋白A与B的直接结合的，而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。
在药物研发的众多靶点中，有一些相互作用的蛋白可以利用蛋白之间的结合特性从而开发相互结合的检测体系，武汉合研利用HTRF，AlphaLISA，报告基因及FP方法开发了多种研究蛋白互作的检测体系，用于新药药效学评价。
3、总蛋白及磷酸化蛋白检测
磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质上的过程。蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素介导的蛋白降解等过程。细胞信号转导活动都是由一系列蛋白传递链构成的，信号传导的过程中涉及到多种蛋白质的可逆磷酸化过程。蛋白质通过可逆磷酸化，以及不同的级联反应，可以将信号放大传递等。由此可见蛋白质磷酸化在细胞信号传导过程中担负着重要的作用。在新药研发涉及到的生物学实验里面，蛋白水平磷酸化和总蛋白降解对于某些靶点来说是重要的药效学评价指标。
检测磷酸化蛋白的抗体是针对该蛋白的特异性磷酸化位点的，而检测总蛋白的抗体一般针对的是该蛋白别的位点，故而磷酸化抗体检测不到总蛋白，而总蛋白抗体能检测包括磷酸化和未磷酸化蛋白在内的目的蛋白。磷酸化蛋白的Western Blotting检测是信号通路研究中的经典方法。大部分实验室具备开展该实验的条件。用 SDS-PAGE 分离生物样品，随后转移到膜（PVDF 或硝酸纤维素膜），采用磷酸化抗体鉴定目的蛋白的磷酸化水平。
由于磷酸化蛋白的检测结果可能随样本处理或操作误差而变化，研究人员通常用同一种蛋白的总表达水平作为参考，通过确定磷酸化蛋白和总蛋白的相对比值来反映磷酸化情况，判断信号通路是否被激活。
常用的WB实验细胞用量大，实验通量比较低。针对研发中的困难，我们采用ELISA，HTRF，Alpha screen等多种方法建立起96孔板的检测体系，一次可以评价多个化合物IC50，大大缩短检测时间。
针对不同的研发项目我们为客户定制开发过Erα，cIAP的蛋白降解检测体系，针对上游不同靶点的pERK检测体系和pSTAT3及pCHK1检测系统。均可高效快速的进行化合物活性评价。
4、酶学靶点开发
酶是生命体内化学反应的催化剂，能够在生理温度和常压下加快化学反应的速度，几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与以提高效率。特定酶活性或者表达量的增强或者缺少都有可能导致生命活动的异常，疾病的发生。在药物研发过程中酶是十分重要的靶点，也是十分有潜力和效果的靶点。
酶学筛选方法的几个核心参数包括酶，反应环境，底物和抑制物。一般来讲反应环境需要查阅文献进行调研，确定PH值，离子强度，洗涤剂等对酶活的影响，底物可以根据酶催化原理选择天然底物，也可以选择合成底物（底物的选择和后续配套的检测方法紧密相关）。一个酶学方法的开发可能涉及到以下一些因素：
底物的选择和配套的检测方式，如下图某蛋白水解酶，其识别的位点是氨基酸线性表位，可以人工合成多肽，在其N端和C端分别加入荧光基团和淬灭基团，正常状态下或者酶活抑制状态，该多肽在酶标仪340nm激发时，其发射光会被淬灭基团吸收，在405nm无信号产生；酶催化反应会将该多肽剪切，当酶标仪340nm激发时，405nm有信号产生。
又如某病毒逆转录酶，合成RNA模板和对应引物，在其引物上进行生物素标记，其中碱基上进行Ru标记，随着酶催化的逆转录反应的进行，引物上不断有Ru标记碱基上去形成核苷酸序列，通过亲和素的板子捕捉引物，检测Ru信号值来评判酶的催化和抑制的活性。
酶学靶点测试是直接反应化合物活性的重要体外测试。在药物筛选初期根据研究的靶点进行酶学测试体系的开发显得尤为重要。通常的药物靶点分为激酶，磷酸酶，蛋白水解酶，表观遗传学酶和DNA修复酶等。根据不同酶类的反应特点不同，我们可以帮助药物筛选研究机构建立不同类型的酶学反应体系。
1、激酶类靶点
通常利用ADP-Glo，LANCE技术或HTRF技术的方法建立反应体系，检测反应中生成的ADP或底物磷酸化来反映反应进程，如本实验室建立的100多种激酶靶点方法。
2、磷酸酶
通过底物被水解后会发生荧光水平的变化来反映反应进程，不同类型的磷酸酶通常还会用到不同的反应底物。利用这种方法本实验室成功建立SHP2 full length homogeneous assay和SHP（E76K）full length homogeneous assay。
3、蛋白水解酶
通过多肽底物被水解后Quencher dye和 Report dye分开从而发出可检测的荧光信号，利用FRET方法建立多种水解酶检测体系，如当前热门的3CLPro和PLPro等。
4、表观遗传学酶
通过HTRF或Alpha的方法检测反应后底物的变化，或SAH的生成情况建立检测体系。如本实验室成功建立的PRMT1，PRMT4，PRMT6，PRMT8等。
5、DNA修复酶
损伤的DNA会激活PARPs酶通过NAD+使核蛋白进行聚腺苷二磷酸核糖基化，从而使组蛋白与DNA分离，通过对底物的生物素标记，检测PARPs的活性，来建立检测体系。如本实验室成功建立的PARP1，PARP2，PARP5a和PARP7等。