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公司新闻/正文
采用THP-1与Caco-2单层膜模型共培养体系研究TNF-α对Caco-2细胞的影响
1096 人阅读发布时间：2020-08-06 15:14
Caco-2细胞单层膜模型是研究药物比较好的体外模型之一，能比较方便的模拟体内环境，其特点在其他文章有专门的讲解，本文就不再赘述了，本文主要是对一篇文章的学习，是在Caco-2细胞单层膜模型基础之上，与THP-1细胞建立共培养体系，进行炎症相关的研究。
摘要
肠上皮细胞通过可溶性因子与位于肠上皮中的免疫细胞相互作用。构建了使用共培养的体外模型系统，以分析巨噬细胞对肠上皮细胞的影响，并且在此研究中使用了人肠上皮样Caco-2单层和活化的巨噬细胞样THP-1细胞。与THP-1细胞共培养导致乳酸脱氢酶从Caco-2释放的增加和单层跨上皮电阻的降低，这表明与THP-1共培养诱导了对Caco-2细胞的损伤。加入抗TNF-α抗体和依那西普可显着抑制这种破坏，强烈表明THP-1分泌的TNF-α对Caco-2单层细胞造成了损害。通过形态和生化分析，被破坏的Caco-2单层细胞既显示凋亡特性又显示坏死特性。 TNFRI和NF-κB似乎参与了该调节。建议该现象在某些方面与IBD所观察到的现象相似，并且该体外共培养系统可能是寻找可用于治疗或预防IBD的药物或食物物质的良好模型。
介绍
胃肠道的粘膜表面衬有一层单层的肠上皮细胞，在它们的顶极之间通过紧密连接而连接在一起，从而形成了一个屏障，该屏障将管腔内容物与下方的效应免疫细胞分开。越来越清楚的是，在肠粘膜表面发生的强烈的免疫活性涉及肠上皮细胞和免疫细胞之间的相互作用。肠上皮细胞应理解为通过可溶性因子受肠上皮单层下的免疫细胞调节。先前的研究表明，肠上皮内淋巴细胞（IELs）是能够响应刺激而分泌细胞因子的效应细胞。 IELs分泌的这些细胞因子包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α），干扰素-γ（IFN-γ）和白介素（IL）-1β，IL-2，IL-4和IL-5。 IFN-γ和TNF-α可以直接作用于肠上皮细胞，介导上皮通透性和电离子迁移能力的改变。除IEL外，巨噬细胞和树突状细胞（DC）也通过诸如细胞因子之类的可溶性因子影响肠道上皮细胞。诸如巨噬细胞之类的免疫细胞的任何异常激活会过度产生炎症细胞因子，从而导致对肠上皮单层细胞的破坏性破坏以及随后的粘膜炎症；例如，炎症性肠病（IBD），例如克罗恩氏病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。然而，通过炎症细胞因子异常平衡的发生仍然未知。
肠道炎症的分析主要是通过使用动物模型进行的。通过使用右旋糖酐硫酸钠（DSS）等诱导的几种结肠炎实验模型已被广泛用于分析肠道炎症。最近还报道了几种细胞因子对基因敲除或转基因小鼠的影响，例如IL-2基因敲除小鼠，IL-10基因敲除小鼠，IL-7基因敲除小鼠。IL-15转基因小鼠表现为结肠炎。这些突变小鼠也已被用作结肠炎的实验模型，以检查或寻找抗炎药或食物因子。但是，这些药物或食物因子的调节机制的细节尚未透露，尤其是在细胞水平上。
因此，我们通过使用人肠上皮样细胞和巨噬细胞，特别是活化的巨噬细胞样细胞之间的共培养，构建了肠道炎症的体外人工模型。该共培养系统用于通过可溶性因子检查不同类型细胞之间的相互作用。以前使用共培养系统的研究报道了神经元与星形胶质细胞，内皮细胞和星形胶质细胞之间的相互作用，这种相互作用已被开发为血脑屏障模型，以及肠上皮细胞和免疫细胞。我们先前已经报道了作为人类肠上皮细胞模型的Caco-2细胞与作为神经元细胞模型的PC12细胞之间的相互作用。我们还报道了肠上皮细胞与免疫细胞之间相互作用的初步结果。
我们进一步表征本研究中肠上皮细胞和活化的巨噬细胞之间的细胞间相互作用。我们还检查了体外共培养系统是否可用于检测药物或食物物质的分析方法，以预防肠道炎症。将人结肠腺癌Caco-2细胞系用作IEC的模型，并通过PMA处理将人急性单核细胞白血病THP-1细胞系分化为活化的巨噬细胞，并将其用作活化的巨噬细胞的模型。
Caco-2培养
Caco-2细胞用DMEM，10％FCS，1％非必需氨基酸，2％谷氨酰胺，100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素和适量的碳酸氢钠组成的培养基培养。将细胞在空气中5％CO2的湿润气氛下于37°C孵育。共培养实验使用在半渗透性支持膜（Transwell插入物； Corning Costar，NY，美国）上的12孔细胞培养插入物中培养的Caco-2细胞，该膜已预先涂有胶原蛋白，密度为1×105细胞/插入。培养2周的Caco-2细胞单层细胞获得的跨膜上皮电阻（TER）大于150Ωcm2的整合细胞单层细胞用于本研究。在第35和65代之间使用了Caco-2细胞。
THP-1培养
用DMEM，10％FCS，2％谷氨酰胺，100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素和适量的碳酸氢钠组成的培养基培养THP-1细胞。将细胞在空气中5％CO2的湿润气氛下于37°C孵育。通过用200 nM佛波醇肉豆蔻酸酯醋酸盐（PMA）处理4天，将用于共培养实验的THP-1细胞分化为巨噬细胞样细胞，然后以3×105细胞/孔的密度添加到12孔板中。
共培养实验
将已培养Caco-2细胞单层14天后置于已在12孔板上培养的巨噬细胞样THP-1细胞上。建立共培养体系。
结论
通过构建体外共培养模型，在这项研究中检查了活化的巨噬细胞THP-1对肠上皮Caco-2细胞单层的影响。发现与THP-1细胞共培养对人肠上皮样Caco-2细胞单层诱导损伤，涉及LDH释放增加和TER值降低。通过添加抗TNF-α抗体，可以完全阻止从Caco-2细胞单层释放的LDH的增加，并且还可以明显地恢复TER值的降低。此外，依那西普还显着抑制了LDH释放的增加，并且TNF-α处理显着诱导了细胞损伤，提示TNF-α是THP-1细胞分泌的初始因子，诱导了对Caco-2细胞单层的损伤。在破坏的Caco-2细胞单层中观察到凋亡和坏死的形态学特征以及caspase-3活性的激活。在各种信号分子中，很可能TNFRI和NF-κB参与了这种调节，而MAP激酶家族则没有。这些发现表明，该共培养系统可以用作诸如IBD之类的肠道炎症的体外模型，并导致可以用于寻找具有抗炎作用的药物或食物物质的简便方法。
就患病人数而言，诸如IBD之类的肠道炎症一直在增加。尤其是，克罗恩氏病的特征是慢性肠道炎症经常复发，并伴有临床表现，包括腹泻，便血，腹痛和体重减轻。迄今为止，克罗恩病的病因尚不明确，但是流行病学和连锁研究表明该患者具有遗传易感性以及环境因素的影响。此外，一些观察结果强烈暗示了在免疫失调的起始过程中肠道菌群的致病作用。目前，用于治疗克罗恩氏病的药物仅限于5-氨基水杨酸酯，皮质类固醇和诸如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤的免疫抑制剂。由于缺乏具有有限毒性或副作用的特异性治疗方法，对开发有效的治疗方法仍然存在强烈需求。然而，肿瘤坏死因子-α抗体（英夫利昔单抗）疗法已被证明是克罗恩病的一种新疗法。抗TNF-α抗体已实质上下调了炎症，导致组织学疾病活动降低，几乎消除了活跃炎症的迹象，并彻底下调了克罗恩氏回肠结肠炎的粘膜炎性介质。此外，抗IL-6受体抗体作为治疗IBD的另一种候选药物正受到关注，这些患者在经过抗TNF-α抗体治疗后仍未从疾病中恢复过来。肠道炎症的原因多种多样，并且通过给予抗TNF-α抗体进行的治疗并非对所有IBD患者有效。因此，有必要根据患者的症状选择最合适的治疗方法。
形态学分析揭示了破裂的上皮Caco-2细胞单层中的凋亡细胞和坏死细胞。受损的上皮Caco-2细胞单层中凋亡细胞的存在也通过caspase-3激活和使用特定caspase-3抑制剂的分析来确定。在IBD患者的肠粘膜中也观察到了这种现象，支持了这种体外共培养模型代表炎症性肠粘膜的有效性。也有报道说，TNF-α引发了凋亡和坏死细胞的死亡途径。已经对凋亡进行了充分的研究，并且在本研究中使用了凋亡的特异性抑制剂，即caspase-3的一般泛特异性抑制剂z-VAD-FMK。另一方面，坏死尚未完全表征。Degterev等最近报道了非凋亡细胞死亡的化学抑制剂necrostatin-1。他们证明，除z-VAD-FMK外，施用7-Cl-Nec-1还可以改善小鼠体内的缺血性损伤，这表明Nec-1可用于治疗涉及凋亡和坏死的疾病。因此，期望通过与THP-1共同培养，可以使用这种新的化学工具更好地表征Caco-2细胞单层的破坏，而坏死抑制素-1可用作治疗IBD的新药。
最后总结，作者使用共培养系统构建了体外IBD模型。尽管该体外模型仍然存在一些问题，但可以预期该共培养系统可以用作筛选具有抗炎作用的食品和化学物质的便捷方法，从而可以预防或改善诸如IBD的肠道炎症。
文献《Induction by activated macrophage-like THP-1 cells of apoptotic and necrotic cell death in intestinal epithelial Caco-2 monolayers via tumor necrosis factor-alpha》
摘要
肠上皮细胞通过可溶性因子与位于肠上皮中的免疫细胞相互作用。构建了使用共培养的体外模型系统，以分析巨噬细胞对肠上皮细胞的影响，并且在此研究中使用了人肠上皮样Caco-2单层和活化的巨噬细胞样THP-1细胞。与THP-1细胞共培养导致乳酸脱氢酶从Caco-2释放的增加和单层跨上皮电阻的降低，这表明与THP-1共培养诱导了对Caco-2细胞的损伤。加入抗TNF-α抗体和依那西普可显着抑制这种破坏，强烈表明THP-1分泌的TNF-α对Caco-2单层细胞造成了损害。通过形态和生化分析，被破坏的Caco-2单层细胞既显示凋亡特性又显示坏死特性。 TNFRI和NF-κB似乎参与了该调节。建议该现象在某些方面与IBD所观察到的现象相似，并且该体外共培养系统可能是寻找可用于治疗或预防IBD的药物或食物物质的良好模型。
介绍
胃肠道的粘膜表面衬有一层单层的肠上皮细胞，在它们的顶极之间通过紧密连接而连接在一起，从而形成了一个屏障，该屏障将管腔内容物与下方的效应免疫细胞分开。越来越清楚的是，在肠粘膜表面发生的强烈的免疫活性涉及肠上皮细胞和免疫细胞之间的相互作用。肠上皮细胞应理解为通过可溶性因子受肠上皮单层下的免疫细胞调节。先前的研究表明，肠上皮内淋巴细胞（IELs）是能够响应刺激而分泌细胞因子的效应细胞。 IELs分泌的这些细胞因子包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α），干扰素-γ（IFN-γ）和白介素（IL）-1β，IL-2，IL-4和IL-5。 IFN-γ和TNF-α可以直接作用于肠上皮细胞，介导上皮通透性和电离子迁移能力的改变。除IEL外，巨噬细胞和树突状细胞（DC）也通过诸如细胞因子之类的可溶性因子影响肠道上皮细胞。诸如巨噬细胞之类的免疫细胞的任何异常激活会过度产生炎症细胞因子，从而导致对肠上皮单层细胞的破坏性破坏以及随后的粘膜炎症；例如，炎症性肠病（IBD），例如克罗恩氏病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。然而，通过炎症细胞因子异常平衡的发生仍然未知。
肠道炎症的分析主要是通过使用动物模型进行的。通过使用右旋糖酐硫酸钠（DSS）等诱导的几种结肠炎实验模型已被广泛用于分析肠道炎症。最近还报道了几种细胞因子对基因敲除或转基因小鼠的影响，例如IL-2基因敲除小鼠，IL-10基因敲除小鼠，IL-7基因敲除小鼠。IL-15转基因小鼠表现为结肠炎。这些突变小鼠也已被用作结肠炎的实验模型，以检查或寻找抗炎药或食物因子。但是，这些药物或食物因子的调节机制的细节尚未透露，尤其是在细胞水平上。
因此，我们通过使用人肠上皮样细胞和巨噬细胞，特别是活化的巨噬细胞样细胞之间的共培养，构建了肠道炎症的体外人工模型。该共培养系统用于通过可溶性因子检查不同类型细胞之间的相互作用。以前使用共培养系统的研究报道了神经元与星形胶质细胞，内皮细胞和星形胶质细胞之间的相互作用，这种相互作用已被开发为血脑屏障模型，以及肠上皮细胞和免疫细胞。我们先前已经报道了作为人类肠上皮细胞模型的Caco-2细胞与作为神经元细胞模型的PC12细胞之间的相互作用。我们还报道了肠上皮细胞与免疫细胞之间相互作用的初步结果。
我们进一步表征本研究中肠上皮细胞和活化的巨噬细胞之间的细胞间相互作用。我们还检查了体外共培养系统是否可用于检测药物或食物物质的分析方法，以预防肠道炎症。将人结肠腺癌Caco-2细胞系用作IEC的模型，并通过PMA处理将人急性单核细胞白血病THP-1细胞系分化为活化的巨噬细胞，并将其用作活化的巨噬细胞的模型。
Caco-2培养
Caco-2细胞用DMEM，10％FCS，1％非必需氨基酸，2％谷氨酰胺，100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素和适量的碳酸氢钠组成的培养基培养。将细胞在空气中5％CO2的湿润气氛下于37°C孵育。共培养实验使用在半渗透性支持膜（Transwell插入物； Corning Costar，NY，美国）上的12孔细胞培养插入物中培养的Caco-2细胞，该膜已预先涂有胶原蛋白，密度为1×105细胞/插入。培养2周的Caco-2细胞单层细胞获得的跨膜上皮电阻（TER）大于150Ωcm2的整合细胞单层细胞用于本研究。在第35和65代之间使用了Caco-2细胞。
THP-1培养
用DMEM，10％FCS，2％谷氨酰胺，100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素和适量的碳酸氢钠组成的培养基培养THP-1细胞。将细胞在空气中5％CO2的湿润气氛下于37°C孵育。通过用200 nM佛波醇肉豆蔻酸酯醋酸盐（PMA）处理4天，将用于共培养实验的THP-1细胞分化为巨噬细胞样细胞，然后以3×105细胞/孔的密度添加到12孔板中。
共培养实验
将已培养Caco-2细胞单层14天后置于已在12孔板上培养的巨噬细胞样THP-1细胞上。建立共培养体系。
结论
通过构建体外共培养模型，在这项研究中检查了活化的巨噬细胞THP-1对肠上皮Caco-2细胞单层的影响。发现与THP-1细胞共培养对人肠上皮样Caco-2细胞单层诱导损伤，涉及LDH释放增加和TER值降低。通过添加抗TNF-α抗体，可以完全阻止从Caco-2细胞单层释放的LDH的增加，并且还可以明显地恢复TER值的降低。此外，依那西普还显着抑制了LDH释放的增加，并且TNF-α处理显着诱导了细胞损伤，提示TNF-α是THP-1细胞分泌的初始因子，诱导了对Caco-2细胞单层的损伤。在破坏的Caco-2细胞单层中观察到凋亡和坏死的形态学特征以及caspase-3活性的激活。在各种信号分子中，很可能TNFRI和NF-κB参与了这种调节，而MAP激酶家族则没有。这些发现表明，该共培养系统可以用作诸如IBD之类的肠道炎症的体外模型，并导致可以用于寻找具有抗炎作用的药物或食物物质的简便方法。
就患病人数而言，诸如IBD之类的肠道炎症一直在增加。尤其是，克罗恩氏病的特征是慢性肠道炎症经常复发，并伴有临床表现，包括腹泻，便血，腹痛和体重减轻。迄今为止，克罗恩病的病因尚不明确，但是流行病学和连锁研究表明该患者具有遗传易感性以及环境因素的影响。此外，一些观察结果强烈暗示了在免疫失调的起始过程中肠道菌群的致病作用。目前，用于治疗克罗恩氏病的药物仅限于5-氨基水杨酸酯，皮质类固醇和诸如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤的免疫抑制剂。由于缺乏具有有限毒性或副作用的特异性治疗方法，对开发有效的治疗方法仍然存在强烈需求。然而，肿瘤坏死因子-α抗体（英夫利昔单抗）疗法已被证明是克罗恩病的一种新疗法。抗TNF-α抗体已实质上下调了炎症，导致组织学疾病活动降低，几乎消除了活跃炎症的迹象，并彻底下调了克罗恩氏回肠结肠炎的粘膜炎性介质。此外，抗IL-6受体抗体作为治疗IBD的另一种候选药物正受到关注，这些患者在经过抗TNF-α抗体治疗后仍未从疾病中恢复过来。肠道炎症的原因多种多样，并且通过给予抗TNF-α抗体进行的治疗并非对所有IBD患者有效。因此，有必要根据患者的症状选择最合适的治疗方法。
形态学分析揭示了破裂的上皮Caco-2细胞单层中的凋亡细胞和坏死细胞。受损的上皮Caco-2细胞单层中凋亡细胞的存在也通过caspase-3激活和使用特定caspase-3抑制剂的分析来确定。在IBD患者的肠粘膜中也观察到了这种现象，支持了这种体外共培养模型代表炎症性肠粘膜的有效性。也有报道说，TNF-α引发了凋亡和坏死细胞的死亡途径。已经对凋亡进行了充分的研究，并且在本研究中使用了凋亡的特异性抑制剂，即caspase-3的一般泛特异性抑制剂z-VAD-FMK。另一方面，坏死尚未完全表征。Degterev等最近报道了非凋亡细胞死亡的化学抑制剂necrostatin-1。他们证明，除z-VAD-FMK外，施用7-Cl-Nec-1还可以改善小鼠体内的缺血性损伤，这表明Nec-1可用于治疗涉及凋亡和坏死的疾病。因此，期望通过与THP-1共同培养，可以使用这种新的化学工具更好地表征Caco-2细胞单层的破坏，而坏死抑制素-1可用作治疗IBD的新药。
最后总结，作者使用共培养系统构建了体外IBD模型。尽管该体外模型仍然存在一些问题，但可以预期该共培养系统可以用作筛选具有抗炎作用的食品和化学物质的便捷方法，从而可以预防或改善诸如IBD的肠道炎症。
文献《Induction by activated macrophage-like THP-1 cells of apoptotic and necrotic cell death in intestinal epithelial Caco-2 monolayers via tumor necrosis factor-alpha》